Le colorazioni citochimiche/istochimiche - Parte 7: la colorazione di Gram

La colorazione di Gram (dal batteriologo danese Hans Christian Gram che l'ha inventata) è uno strumento utilizzato per la classificazione batterica e basato sulla colorazione che questi microrganismi assumono al microscopio dopo uno specifico trattamento.

La differenza di colore tra i batteri deriva dalla costituzione della loro parete: in particolare, i Gram positivi hanno una parete batterica ricca di peptidoglicano; al contrario i Gram negativi hanno una parete batterica contenente solo il 20% circa di peptidoglicano. Inoltre i Gram positivi presentano una membrana esterna ricca di fosfolipidi.

La tecnica prevede una colorazione differenziale che sfrutta l’utilizzo di due coloranti principali, il cristalvioletto e la safranina, e due soluzioni, quella di lugol e quella decolorante:

1) il cristalvioletto colora indistintamente tutte le cellule e permette ai batteri Gram positivi di colorarsi di viola/blu

2) la soluzione di Lugol ha funzione mordenzante che ha affinità con il cristalvioletto, creando un complesso più stabile nei Gram positivi e che eviterà la successiva decolorazione degli stessi

3) il decolorante attacca le strutture lipopolisaccaridiche della membrana esterna, che si trova solo nei batteri Gram negativi, permettendo al colorante di fuoriuscire dal sottile strato di peptidoglicano

4) la safranina è il colorante di contrasto che permette ai Gram negativi di assumere una colorazione rossa

La colorazione sfrutta dunque la capacità/ incapacità dei batteri di trattenere o meno il complesso cristalvioletto - lugol. Vengono definiti gram-positivi i batteri che trattengono il colorante primario (cristalvioletto), resistono alla decolorazione con una miscela di alcol e acetone e risultano colorati in blu/viola. Vengono definiti gram-negativi quelli che vengono decolorati, perdono il colore primario e si presentano di colore rosa in seguito alla colorazione di contrasto (safranina).

Tale colorazione viene consigliata dai patologici qualora si sospetti un’infezione batterica: la presenza di una popolazione univoca di batteri Gram-negativi, Gram-positivi o mista, può orientare il clinico verso una terapia antibiotica più mirata, in attesa di un eventuale esame microbiologico. Nella foto a fianco un esempio di essudato settico pleurico in un gatto, in cui tra numerosi batteri Gram-negativi rossi, si notano strutture filamentose Gram-positive blu riferibili a Nocardia/Actinomyces.

Maria Massaro & Walter Bertazzolo